Electroforesis de proteínas séricas en tiras de acetato de celulosa (Cellogel)

Materiales a utilizar
Una fuente de alimentación 0 – 300 V
Una cubeta de electroforesis con puentes
Aplicador semimicro con 4 depósitos
Micropipetas
Cubetas
Agitador
Estufa

Reactivos
Tiras de acetato de celulosa Cellogel
Disolución tampón
Tiras Mylar (soportes para transparentar)
Líquido colorante (Rojo Ponceau)
Líquido decolorante (ácido cítrico)
Solución transparentadora
Muestra
Suero

Preparación de la muestra
Pipetear 30 l de muestra en los salientes del aplicador de muestras

Preparación de reactivos
Tampón de electroforesis (Tris):
1. Mezclar los 100 ml del tampón Tris Hippurate concentrado con 1000 ml de agua destilada (se puede preparar menos cantidad respetando siempre las proporciones).
Líquido decolorante (Ácido cítrico):
1. Disolver 1 paquete de polvo de Ácido Cítrico en 1000 ml de agua desionizada
2. Agitar hasta que el polvo se disuelva completamente

Método
1. Tomar una tira de Cellogel y sumergirla en una cubeta que contenga 100 ml de tampón. Agitar en el agitador de bandeja durante 10 – 15 minutos.
2. Sacar la tira de la cubeta (el tampón se recupera) y retirar el exceso de tampón poniéndola entre 2 láminas de papel de filtro.
3. Posicionar la tira Cellogel sobre el puente con la cara porosa hacia arriba, las tiras vienen con un corte en una de sus esquinas, ese corte debe estar en la parte inferior derecha del operador.
4. Introducir el puente en el interior de la cubeta.
5. Cargar el aplicador múltiple con 30 l del suero en cada muesca.
6. Bajar el aplicador sobre las muescas varias veces para que se cargue correctamente.
7. Descargar las muestras sobre un papel de filtro situado en la mesa (se desecha esta primera tanda).
8. Volver a cargar las muestras de nuevo y descargar las muestras sobre la tira de acetato de celulosa.
9. La siembra se hace a 2 cm del cátodo (polo (-)). Mantener pulsado el aplicador durante 10 segundos para cerciorarnos que la muestra penetre en la tira.
10. Rellenar completamente los 2 compartimentos de la cubeta con tampón de electroforesis. El tampón de electroforesis puede reutilizarse hasta 3 veces.
11. Se enciende la fuente de alimentación y se aplican 200 V (voltaje constante) durante 35 minutos. Ojo, NO meter la mano en la cubeta mientras esté enchufada.
12. Transcurrido el tiempo se desconecta la fuente de la red y se saca la tira Cellogel del puente. Ojo, si se manipula, las manos deben estar bien limpias y desengrasadas.
13. Se traslada la tira cortándole ambos extremos (dejamos sólo la parte donde se encuentra el suero ya fraccionado) a un recipiente con el líquido colorante (Rojo Ponceau).
14. Agitar durante 5 minutos. Posteriormente recuperar el Rojo Ponceau a su frasco y lavar suavemente con agua destilada para retirar el exceso de colorante.
15. Pasar la tira al recipiente con líquido decolorante (Ácido Cítrico), agitar y hacer sucesivos lavados hasta que quede el fondo completamente blanco. en este momento ya se visualizan perfectamente las fracciones, pero falta transparentar
16. Para transparentar se introduce la tira en la disolución transparentadora. Agitar durante 1 minuto.
17. Colocar la tira de Cellogel sobre un papel Mylar. Cortar los bordes y retirar el exceso de disolución evitando la aparición de burbujas (podéis utilizar un bolígrafo a modo de rodillo). La disolución transparentadora se recupera.
18. Colocar la película en el interior de una estufa a 80ºC durante 10 minutos para completar la transparentización.
19. Sacar de la estufa y dejar enfriar.
20. Escanear la película y realizar la densitometría con el programa informático Scion.

***En nuestro caso, aclaramos el fondo de la tira con agua destilada y no realizamos el proceso de transparentación de la muestra.