Очистка белка – заливка и заполнение агарозной колонки

GoldBio предлагает ассортимент предварительно упакованных смол; однако самостоятельная упаковка колонок может быть более экономичным решением. Мы предлагаем широкий выбор пустых колонок для ваших конкретных задач. В этом видеоролике по очистке белка будут продемонстрированы методы упаковки объёмной агарозной аффинной смолы в многоразовую колонку для очистки. После заливки колонка готова к немедленному использованию или хранению. Храните колонку в вертикальном положении при температуре 4 °C. Хотя срок годности составляет около четырёх недель, мы рекомендуем упаковывать только те колонки, которые будут использованы в течение одной недели.

Необходимые материалы:

Аффинная смола: https://www.goldbio.com/collections/a...

Деионизированная вода

Уравновешивающий/связывающий/промывочный буфер (с низкой концентрацией имидазола) https://www.goldbio.com/products/his-...

Пустая пластиковая колонка с нижним и верхним стопорами https://www.goldbio.com/products/plas...

Стакан или трубка для сбора потока

Кольцевой штатив с зажимом

Небольшая воронка для начала колонки

Полностью дегазируйте агарозную смолу и буфер перед добавлением чего-либо в колонку.

Добавьте один объём промывочного буфера для смолы в пустую колонку и медленно капайте через неё, чтобы удалить пузырьки воздуха из-под фритты. Если пузырьки воздуха остались, постучите по колонке, чтобы удалить их. Если пузырьки воздуха остались, колонку можно центрифугировать на низких оборотах.

Осторожно встряхните флакон, чтобы получить гомогенную суспензию агарозных частиц (Ni, Co, Cu, Zn или без металлов). Поместите воронку в головку колонки, затем откройте нижнюю крышку, чтобы начать поток буфера через колонку. Медленно распределите суспензию агарозных частиц по стенкам колонки. Запустите колонку и продолжайте заливать суспензию в колонку до достижения желаемой высоты слоя. Не допускайте полного оседания частиц в колонке. Лучшие колонки получаются при непрерывном наполнении. Если вы случайно допустили оседание частиц, перемешайте верхнюю часть осевшей матрицы пипеткой, а затем продолжайте добавлять новые агарозные частицы в колонку. Не допускайте полного оседания колонки. Если колонка полностью осядет, необходимо перезалить колонку. Если вы используете адаптер потока, вставьте его в головку колонки до начала вытеснения жидкости. Убедитесь, что под спеченным диском адаптера потока не попал воздух.

Смойте консервант со смолы, добавив 5–10 объемов колонки буфера или
DI-HZO и пропустив его через колонку, снова убедившись, что колонка не
высохнет.

Если вы используете колонку немедленно, приступайте к ее уравновешиванию. При хранении
колонки добавьте немного меньше одного объема колонки буфера или
DI-HZO, закройте
нижнюю и верхнюю крышки и храните вертикально при температуре 4°C. Для предотвращения роста микроорганизмов можно добавить азид натрия до конечной концентрации 0,02%.

Уравновешивание колонки

Уравновешивайте колонку, добавив 5–10 объемов колонки промывочного буфера для смолы Ni/Cu/Co. Обязательно дегазируйте все растворы перед добавлением в колонку, чтобы избежать образования пузырьков.

Запуск колонки

Загрузите лизат (содержащий солюбилизированный 6-кратно меченный гистидином белок) в колонку. Контролируйте скорость потока добавления лизата. Рекомендуемая скорость потока для связывания составляет 12 мл в час для колонки объёмом 1 мл. В качестве альтернативы можно загрузить в колонку третью часть объёма колонки и дать материалу связаться в течение пяти минут перед добавлением следующего объёма лизата.

Промойте колонку промывочным буфером для смолы Ni/Cu/Co в объёме 10 объёмов колонки. Скорость потока для колонки объёмом 1 мл может составлять 30 мл в час. Избегайте сжатия агарозных частиц. Не сжимайте агарозные частицы, применяя слишком большое давление с помощью насоса или большого напорного давления.

Элюируйте белок одним из следующих методов:
a. Примените линейный градиент имидазола 10 мМ к 50 мл/л имидазола в фосфатном буфере, pH 8 (https://www.goldbio.com/products/5x-p..., или

б. Используйте ступенчатый градиент буфера для элюирования гистидина и белка (элюируйте имидазолом SUOrnIVI, 400 мм и 500 мм в буфере для элюирования гистидина и белка).

Для ступенчатого градиента разбавьте буфер для элюции белка гистидином фосфатным буфером с pH 8:

100 мМ (50 мл) = 10 мл гистидина : 40 мл фосфата

200 мМ (50 мл) = 20 мл гистидина : 30 мл фосфата

300 мМ (50 мл) = 30 мл гистидина : 20 мл фосфата

400 мМ (50 мл) = 40 мл гистидина : 10 мл фосфата

Независимо от используемого метода элюирования, необходимо собирать фракции,
соизмеримые с объёмом колонки. Белок
теоретически должен элюироваться во включённом объёме колонки, что примерно эквивалентно двум третям объёма колонки.