Спектроскопия || Закон Ламберта-Бера

#биологическаяанимация #биофизика #спектроскопия #спектрофотометр

Полный текст учебной заметки можно найти здесь👉 https://rethinkbiologynotes.com/spect...

Сегодня мы изучим спектроскопию и закон Ламберта-Бера.

Что такое спектроскопия?

Это наука о взаимодействии электромагнитного излучения с веществом.
Веществом могут быть любые атомы, молекулы или ионы.
Электромагнитный спектр простирается от очень коротких длин волн, таких как гамма-лучи, до длинных, таких как радиоволны.
Видимый диапазон составляет примерно 400–700 нанометров.
Теперь перейдем к типам спектроскопии.
Когда электромагнитное излучение встречает вещество, оно может поглощать, испускать или рассеивать его.
В зависимости от этого существует три типа спектроскопии: абсорбционная, эмиссионная и рассеивающая.
Сегодня мы поговорим только об абсорбционной спектроскопии. Основной принцип абсорбционной спектроскопии заключается в том, что при прохождении монохроматического света через раствор или вещество часть его излучения может поглощаться.
Это поглощение измеряется с помощью прибора, называемого спектрофотометром.
Закон Ламберта-Бера основан на двух различных законах.
Закон Ламберта гласит, что при прохождении монохроматического света через прозрачную среду интенсивность прошедшего света экспоненциально уменьшается с увеличением толщины поглощающего материала.
Закон Ламберта-Бера гласит, что интенсивность прошедшего монохроматического света экспоненциально уменьшается с увеличением концентрации поглощающего вещества.
Этот закон Ламберта-Бера можно математически выразить формулой:
A = log I_o/I = εcl
Где A — поглощение, I_o и I — интенсивности падающего и прошедшего света соответственно.
ε — коэффициент возбуждения, постоянный для конкретного вещества.
C — концентрация образца, l — длина оптического пути. T относится к коэффициенту пропускания, который выражается отношением I к I_o.
Если мы выведем зависимость поглощения от процентного пропускания из приведенной выше формулы, то получим, что поглощение равно 2-〖log〗_10%T.

Таким образом, в спектрофотометре можно получить как показания поглощения, так и пропускания.

Теперь посмотрим, если увеличить концентрацию образца, поглощение увеличится, а пропускание уменьшится.

Однако, если изменить длину пути, поглощение увеличится, а пропускание уменьшится.

Теперь перейдем к применению спектрофотометра. Например, мы проводим оценку белка.

Предположим, у вас есть образец белка неизвестной концентрации, и вы хотите оценить его концентрацию.

Сначала вам нужно взять серию образцов белка известных концентраций вместе с холостым раствором.
Теперь вам нужно добавить реагенты во все пробирки.
Белок окрасится после реакции с реагентами.
Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации белка.
Теперь вам необходимо измерить поглощение для каждой известной концентрации белка в вашем образце.
Построив график, вы получите стандартную кривую.
На основе стандартной кривой рассчитывается значение поглощения 1.
Теперь, используя формулу, вы можете рассчитать концентрацию белка в неизвестном образце.
Помимо оценки содержания белка, спектроскопия используется для измерения концентрации ДНК/РНК в ферментативных анализах, ИФА или для измерения любых концентраций молекул, дающих любой цвет в УФ-видимом диапазоне в растворе.